آموزشی میکروسکوپ های فاز کنترواست

[Ramina.p]

مقدمه
احتمالا مهمترین پیشرفتی که در تکنیک میکروسکوپی در سالهای قبل از 1960 حاصل شد توسعه میکروسکوپهای فاز کنتراست و تداخلی بود. در این نوع میکروسکوپها بافتهای زنده را در حالی که ثابت نشده‌اند (unstained) می‌توان با کانتراست خوب و رزولوشن مناسب مشاهده نمود. برای آنکه بتوان جزئیات یک شیئی را قابل رویت نمود. این عمل را با رنگ آمیزی می‌توان انجام داد. در صورتی که شیئی مورد نظر رنگ آمیزی نشده (unstained) باشد می‌توان بدون دخالت در ساختمان یا حیات آن شیئی ضریب انکسار قسمتهای متعددی از آنرا کم یا زیادتر از ماده‌ای که شیئی در آن قرار دارد نمود. در صورتی که اختلاف ضریب شکستها خیلی کم باشد. به گونه‌ای که قابل مشاهده نباشد می‌توان از میکروسکوپ زمینه تاریک استفاده نمود. میکروسکوپ زمینه تاریک عمدتا نشان دهنده لایه‌های سطحی نمونه بجای ساختمان داخلی می‌باشد.

 

[Ramina.p]

علاوه بر آن لازمه این سیستمها استفاده از لامپهای با قدرت زیاد می‌باشد که بعضا وقتی که مدت زمان مشاهده زیاد باشد بایستی از سیستم خنک کننده استفاده شود. این در حالی است که میکروسکوپ فاز – کنتراست دارای این اشکالات نمی‌باشد و می‌توان ساختمان داخلی شیئی را بخوبی مشاهده نمود. در حالت کلی بخشهایی از شیئی که دارای ضرائب انکسار زیادتر باشند در مقایسه با زمینه روشنتر تاریک و یا بلعکس می‌باشد که البته این مطلب بستگی به نوع سیستم – منفی یا مثبت بودن میکروسکوپ دارد. لامپ نوری مورد استفاده در این نوع میکروسکوپ یک لامپ معمولی می‌باشد و همه دهانه عدسی شیئی در تشکیل تصویر شرکت می‌نمایند. در این نوع میکروسکوپ و رزولوشن نسبت به زمینه تاریک ضعیفتر است و این بخاطر پدیده شکست نور و تغییر فاز آن می‌باشد.

 

[Ramina.p]

اصول کلی
هدف از این میکروسکوپها قابل دیدن نمونه‌هائی است که موجب تغییر قابل توجهی در شدت (دامنه) نور عبوری از آن مثل حالت نمونه‌های رنگ آمیزی شده (stained) نمی‌باشد. تنها تغییری که اجزاء مختلف این گونه نمونه‌ها بر روی نور عبوری بوجود می‌آورند آن است که موجب تغییر در فاز آنها می‌شود. به عبارت دیگر در روشهای میکروسکوپهای معمولی سیستم ساختمانی نمونه به گونه‌ای است که اجزاء مختلف آن دارای خاصیت جذب متفاوت نور برخوردی به آنها می‌باشد و بدین لحاظ نور عبور کرده از نمونه در قسمتهای مختلف دارای شدتهای مختلفی می‌باشند که این تغییر در شدت بستگی به مقدار جذب در قطعات و اجزاء مختلف نمونه وارد و بنابراین ناحیه‌ای که جذب کمتر اتفاق می‌افتد تصویر شیئی روشنتر و بخشهای با جذب بیشتر تاریکتر مشاهده می‌شوند. در این نمونه‌ها تصویر از نور عبور نموده از نمونه تشکیل می‌شود. بسیاری از نمونه‌ها شدت نور عبور نموده را تغییر چندانی نمی‌دهند و لیکن اجزاء مختلف موجب تغییر فاز نور عبور نموده از آنها می‌شوند و لیکن با توجه به آنکه چشم حساس به فاز یا تغییر فاز نمی‌باشند لذا بایستی به نحوی این تغییر فاز را قابل مشاهده نمائیم. بنابراین هدف از میکروسکوپ فاز کنتراست تبدیل تغییر فاز به تغییر دامنه است که بتواند بوسیله چشم قابل مشاهده شود.

وقتی که نور از کندانسور عبور نموده و به شیئی برخورد نماید در آن صورت به دلیل پدیده تفرق حاصله در اثر جسم طیف تفرق یافته در پشت عدسی چشمی حاصل می‌شود. با توجه به آنکه جسم مثل یک شبکه متفرق کننده عمل می‌نماید در آن صورت تصویر در این شبکه در اثر تفرق در پشت عدسی چشمی ایجاد می‌شود. تصویر حاصله که نشان دهنده جزئیات جسم است در اثر ترکیب نور متفرق شده و نور عبور نموده بدون تفرق ایجاد می‌شود. به علت آنکه بین نور متفرق شده و نور عبور نموده بدون تفرق ایجاد می‌شود. به علت آنکه بین نور متفرق شده و نور مستقیم اختلاف فاز وجود دارد لذا این دو نوع پرتو با همدیگر ترکیب شده و تداخل انجام می‌شود و در نتیجه اختلاف فاز این دو نوع نوز ایجاد تغییر در دامنه یا شدت نور در صفحه تصویر می‌نماید. میکروسکوپهای فاز – کنتراست بگونه ای طراحی شده اند که تغییر فاز حاصله در اثر وجود نمونه و تغییر فاز در اثر تغییر ضریب شکست در اجزاء مختلف آن این تغییر فاز به تغییر شدت تبدیل شود.

 

[Ramina.p]

در صورتی که نورهای عبور نموده از جزهای مجاور همدیگر دارای اختلاف فاز ناچیز باشند در آن صورت اختلاف فاز بین تقریبهای صفر و یک برابر λ 4/0 خواهد بود. در آن صورت به دلیل این اختلاف فاز نور ترکیب شده ، تشکیل نوارهای تداخلی می‌نماید. حال اگر توجه نمائیم نور عبور نموده از طرف دیگر نیز به همین شکل دارای اختلاف فاز ولی در جهت عکس همدیگر می‌شوند و لذا نور رسیده به آن نقطه صفر می‌باشد و بنابراین ساختمان شیئی قابل رؤیت نمی‌باشد. در میکروسکوپهای فاز کنتراست تأثیر یک مانع با ضخامت λ 4/0 آن است که موجب هم فاز ساختن نوارهای تداخلی از دو طرف شود و در نتیجه افزایش دامنه حاصل می شود.

سیستم ساختمانی یک میکروسکوپ فاز کنتراست استاندارد به گونه‌ای است که یک روزنه دایره ای شکل در محل صفحه کانون کندانسور substage وجود دارد که شیئی بوسیله یک دسته پرتو مخروطی شکل روشن می‌شود. تویر مستقیم این دایره روشن بوسیسله عدسی شیئی در محل کانون F عدسی شیئی تشکیل می‌شود. همچنین روی این صفحه تصویرهای متفرق شده بوسیله شیئی و ساختمان داخلی شیئی بر روی این صفحه تشکیل می‌شود. البته تصویر بر روی این صفحه تشکیل می‌شود و تصویر متفرق شده از محل مربوطه بر روی این صفحه F جابجا می‌گردد. در محل کانون F یک صفحه قرار دارد که این صفحه وظیفه‌اش آن است که به اندازه λ 4/0 بین دو دسته پرتوئی که بطور مستقیم از شیئی عبور نموده و دسته پرتوئی که متفرق شده است اختلاف فاز ایجاد می‌نماید.

 

[Ramina.p]

امواج متفرق شده و عبور کرده بطور مستقیم از صفحه در محل کانون شیئی با همدیگر ترکیب و موجب ایجاد نوارهای تداخلی با شدت ماکزیمم و مینیمم می‌نماید و در نتیجه این عمل ذره‌ای که در داخل جسم قرار دارد در صورتی که ضریب انکسار آن بیشتر از ضریب انکسار ناحیه مجاورش باشد بصورت یک منطقه تاریک ظاهر می‌شود. در صورتی که صفحه فاز (phase-plate) موجب جلو انداختن فاز موج عبوری به اندازه λ 4/0 باشد در آن صورت تصویر نقطه تاریک (positive phase plate) و در صورتی که موجب عقب انداختن نور بدون برخورد به اندازه λ 4/0 شود. تصویر نقطه بصورت روشن (negative phase contrst) ظاهر می‌شود. پس از ابداع این نوع میکروسکوپ بزودی مشخص شده که اگر صفحه‌ای که جاذب نور است بر روی حلقه صفحه تغییر دهنده فاز قرار بگیرد بطوری که دامنه موج مستقیم عبوری از آن کمی تضعیف شود در آن صورت تصویر حاصله به حد زیادی بهتر می‌شود.

 

[Ramina.p]

ملزومات یک میکروسکوپ فاز – کنتراست
علاوه بر اجزاء اصلی یک میکروسکوپ معمولی ، یک میکروسکوپ فاز کنتراست همچنین دارای اجزاء زیر می‌باشد:


این میکروسکوپ دارای چشمه نور قوی می باشد که نور آن از طریق یک حلقه بر کندانسور
حلقه دیافراگم روشنایی
کندانسور
صفحه شیئی
نور مستقیم
نور پراکنده شده
عدسیهای شیئی
صفحه تصویر
با میکروسکوپها لازم است که حلقه‌هایی با اندازه‌های متفاوت همراه باشد به گونه‌ای که با هر عدسی شیئی دیافراگم مناسب استفاده شود. به عنوان مثال یک دیافراگم با قطر کوچک با عدسی شیئی 16 میلیمتری و یک دیافراگم با قطر بزرگ با عدسی شیئی 2 میلیمتری استفاده می‌شود. موقعیت محل دیافراگم در پشت کندانسور به گونه‌ای است که تصویر آن در محل کانون عقبی عدسی شیئی تشکیل می‌شود. علاوه بر آن بایستی میکروسکوپ دارای عدسیهای شیئی مخصوص باشند. این عدسی‌ها مثل عدسیهای شیئی معمولی می‌باشند با این تفاوت که دارای یک صفحه فاز (phase palate) در محل کانون عقبی آن در محل تصویر دیافراگم می‌باشند. صفحه فاز یک صفحه شیشه‌ای می‌باشد که دارای ناحیه دایره‌ای با ضخامت کمتر در محل ویژه‌ای بر روی آن (negative) یا برآمدگی (positive) می‌باشد. ضخامت این ناحیه به گونه‌ای است که موجب ایجاد تقدم یا تأخیر فاز در نوری که از آن می‌گردد نسبت به نوری که از ضخامت بیشتر مجاورش عبور می‌کند می‌شود. معمولا سه نوع عدسی شیئی در سیستمهای فاز کنتراست وجود دارد این عدسیها بر حسب اختلاف در کنتراست از همدیگر متمایز می‌شوند و عبارتند از:

 

[Ramina.p]

a) عدسیهای شیئی DL,DM: این دو نوع عدسی در حالت زمینه روشن بکار می‌روند. استفاده از این عدسیها موجب ایجاد تصویر تاریکی از نمونه در زمینه نسبتا روشن می‌شود. استفاده از عدسی DM موجب جذب متوسط نور مستقیم می‌شود و لذا زمینه تا حد متوسطی روشن می‌باشد. استفاده از عدسی DL موجب جذب کمی از نور مستقیم می‌شود و لذا موجب ایجاد زمینه روشنتری نسبت به استفاده از عدسی DM می شود.


b) عدسیهای شیئی BM: این نوع عدسی در حالت زمینه تاریک استفاده می‌شود.

نکته قابل توجه در مورد عدسیهای شیئی مورد استفاده در میکروسکوپهای فاز کنتراست دامنه عمل آنها می‌باشد. در میکروسکوپهای زمینه روشن وقتی اختلاف فاز نورهای عبوری افزایش یابد تصویر تاریکتر می‌شود. اگر اختلاف فاز از حد معینی بیشتر شود تصویر روشن به روشن شدن می‌نماید تا اینکه دارای روشنائی با زمینه خواهد شد. در این حالت دیگر تصویر قابل دیدن نخواهد بود. بنابراین بایستی توجه داشت که اختلاف فاز مجاز در این میکروسکوپها برای مشاهده تصویر دارای حد معینی است. محدوده قابل تغییر برای آنکه تصویر قابل مشاهده باشد را دامنه عمل می‌نامند. هر چقدر دامنه عمل بیشتر باشد برای مشاهده تصویر مناسبتر است. عدسیهای شیئی DL دارای دامنه عمل زیاد می‌باشند. استفاده از عدسیهای شیئی با دامنه عمل زیاد در مواردی توصیه می‌شود که اختلاف فاز نمونه خیلی کم می‌باشد این عدسیها موجب افزایش کنتراست می‌شود. عدسیهای DM دارای دامنه عمل کم می‌باشد.


c) یک تلسکوپ کناری جهت مشاهده تصویر ایجاد شده در کانون عقبی شیئی لازم است. موقع استفاده از این تلسکوپ به جای عدسی چشمی معمولی قرار گیرد، این تلسکوپ را بایستی جهت تنظیم میکروسکوپ بکار برد. در صورتی که این تلسکوپ را با عدسی چشمی جایگزین نمائیم تصویر حلقه فاز و دیافراگم حلقوی قابل رؤیت خواهد بود. در صورتی که این دو تصویر بر هم منطبق نباشند با استفاده از پیچهای مربوطه می‌توان این دو را تنظیم نمود.

 

[Ramina.p]

d) هنگام مشاهده نمونه‌ها با میکروسکوپهای فاز کنتراست اغلب بخاطر آنکه حساسیت چشم انسان به طول موجهای بیشتر است از فیلتر سبز استفاده می‌شود. طول موجهای مذکور بسادگی از این فیلتر عبور می‌نمایند و وضوح تصویر بیشتر خواهد بود. این فیلترها موجب ایجاد راحتی بیشتری برای مشاهدات طولانی نیز می‌شوند. علاوه بر این فیلترها اغلب مناسب است که از فیلترها IR نیز جهت جذب گرما استفاده زیرا شدت نور مورد استفاده بسیار زیاد است و می‌تواند موجب آسیب به نمونه در اثر گرما شود.

 

[Ramina.p]

روش استفاده از میکروسکوپ فاز – کنتراست
نحوه کار با میکروسکوپ فاز – کنتراست در انواع مختلف آن متفاوت است و لذا بایستی بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده عمل نمود و لیکن در اکثر آنها نحوه کار با آن به شرح زیر می‌باشد:
لامپ را روشن نموده و سپس به تدریج شدت آنرا تا نصف یا 4/3 شدت ماکزیمم افزایش دهید. روزنه لامپ و کندانسور substage را کاملا باز نمائید. امتحان نمائید که فیلتر نوری در محل خود بطور مناسب واقع است. حلقه‌هایی که در زیر کندانسور واقع است را کنار بزنید.

در ابتدا با استفاده از عدسی شیئی با توان بالا (mm 4 عدسی شیئی خشک) شروع نمائید. فوکوس سیستم را تنظیم نموده به گونه‌ای که شیئی و stage را بخوبی بتوان تفکیک نمود. پس از آن عدسی شیئی را به موقعیت مربوطه‌اش منتقل نمائید.

کندانسور زیر stage را بگونه‌ای تنظیم نمائید که حدود 5 میلیمتر زیر stage واقع شود.

اسلاید را که حاوی نمونه است و همچنین لامپ آن را بر روی stage قرار دهید به گونه‌ای که فیلم به سمت بالا واقع شود. با فشار کمی بر روی اسلاید اتصال یکنواختی با stage فراهم آورید.

تصویر را فوکوس نموده و همچنین توجه شود که در وجود حباب بتوان آنرا مشاهده و سپس حذف نمود. جهت فوکوس نمودن اگر خطی بر روی اسلاید قرار دارد و یا آنکه در صورت نبودن می‌توان از خود نمونه برای فوکوس نمودن استفاده نمود. عمل فوکوس کردن با یستی بدقت انجام شود.

یکی از عدسیهای چشمی را برداشته و بجایش تلسکوپ مربوطه را بگذارید. با حرکت دادن آن ، آنرا برای صفحه فاز در بالای عدسی شیئی فوکوس نمائید. فوکوس میکروسکوپ را تغییر نداده و توسط چشمی کنترل کندی که فوکوس آن تغییر نکرده است.

صفحه دیافراگم مناسب عدسی شیئی مورد استفاده را در محل خود بین کندانسور و لامپ قرار دهید. سپس کندانسور را فوکوس نمائید بگونه‌ای که تصویر حلقه روشن از داخل تلسکوپ برابر با حلقه روی صفحه فاز باشد. مجددا از طریق چشم دیگر که هنوز در محل خودش قرار دارد ببنید که هنوز تصویر فوکوس می‌باشد.

با کنار زدن دیافراگم مجددا به داخل تلسکوپ نگاه نموده و با تغییر پیچهای مربوط به کندانسور آنرا بگونه‌ای تنظیم نمائید که تصویر فیلمان بطور واضح روی حلقه مربوط به صفحه فاز قرار گیرد.

دیافراگم را مجددا به محل خود برگردانید در حالی که بداخل تلسکوپ نگاه می‌کنید و سپس دیافراگم را به مرکز بوسیله پیچهای مربوطه منتقل نمائید. حلقه روشن بایستی دقیقا در بین حلقه‌های صفحه فاز قرار گیرند. لبه‌های این دو بایستی بر روی همدیگر بیفتد و در ضمن بایستی برنگ سفید باشد و نه رنگ دیگر. اندازه حلقه نوری را می‌توان با تنظیم فوکوس کندانسور تنظیم نمود.

 

[Ramina.p]

مجددا از طریق عدسی چشمی که هنوز در محل خود قرار دارد به نمونه نگاه کرده و امتحان کنید که هنوز سیستم فوکوس می‌باشد. در صورت لزوم بایستی فوکوس را تنظیم نمود. در این حالت با نگاه به داخل تلسکوپ مجدددا حلقه نور را تنظیم نمائید.

تلسکوپ را خارج نموده و مجدددا عدسی چشمی دوم را سر جایش بگذارید. نمونه را مورد مطالعه قرار داده ضمن آنکه در صورت نیاز بایستی نور را نیز تنظیم نمائیم با حرکت دادن نمونه می‌توان ضخامتها و نواحی مختلف نمونه را بررسی و مطالعه نمود. هر از چند گاهی با جایگزین تلسکوپ وضعیت حلقه روشن را امتحان نمائید.

آزمایش با عدسی mm 2 امیرسیون روغنی: فوکوس سیستم را چرخانده به گونه‌ای که بوضوح بتوان اسلاید و عدسی شیئی را مشاهده نمود. دیافراگم را برداشته و سپس یک قطره روغن روی لامل قرار دهید. عدسی mm 2 ایمرسیون روغنی را به محل خود منتقل نموده و سپس فوکوس را حرکت داده به گونه‌ای که بین عدسی شیئی و روغن تماس برقرار شود. مراحل 14 تا 11 را با استفاده از دیافراگم مناسب عدسی مورد استفاده تکرار نمائید.