مطالعات رونتگن بیشتر دربارهٔ الکتریسیته و نور و گرما بود و سرانجام او با پیگیری مطالعات سر ویلیام کروکس، پرتو ایکس را کشف کرد.
کشف رونتگن اولین کشف از سری کشفها دربارهٔ رادیو اکتیویته بود که کشفهای بکرل، کوری، رادرفورد، ماکس پلانک، تامسون، انیشتین و انریکو فرمی را در برمیگرفت.
پرتو X، پرتوی با طول موج بسیار کوتاه و قابلیت نفوذ بسیار زیاد است، و از بیشتر مواد میگذرد. فیزیکدانان برای آنالیز مواد بلوری، بسیار از این پرتو بهره بردهاند، و در پزشکی نیز به نامهای رادیوگرافی و رادیولوژی بهکار میرود.
در هشتم نوامبر ۱۸۹۵، رونتگن، سرگرم کار روی پرتو کاتدی با لوله کروکس-هیتورف بود. این لوله که در آن زمان بارها از سوی فیزیکدانان استفاده میشد، حباب شیشهای داشت که هوای آن تقریباً تخلیه شده، دو الکترود به فاصله چند سانتیمتر از هم در آن قرار داشتند. با برقراری اختلاف پتانسیل زیاد، در حدود چندین هزار ولت، بین الکترودها، پرتو کاتدی (الکترونها) از کاتد (الکترود منفی) به آند (الکترود مثبت) میرفتند، به عبارت دیگر، به مسیر خود ادامه میدادند تا به دیوارهٔ شیشه لوله برخورند.
رونتگن در صفحه کاغذ آغشته به کریستالهای پلاتین، سیانور و باریم که در کنار لوله کروکس-هیتورف قرار داشت فلورسانس درخشانی دید. وی پرتویی را که بسیار پرنفوذتر از پرتوی کاتدی بود، کشف کرد. سپس رونتگن مشتاقانه در چند هفته با پیگیری این ایده و با تجربهٔ دقیق، به بررسی ویژگیهای این پرتو، که آن را پرتو ایکس نامید، پرداخت. کشف پرتو ایکس و کاربرد وسیع آن در تصویربرداری پزشکی، به نجات انسانهای زیادی انجامید، بهگونهای که تصور علم پزشکی بدون تصویربرداری پرتو ایکس، سخت است.